ZEMAX | 使用點擴散函數(shù)的衍射極限成像系統(tǒng)的分辨率

成像系統(tǒng)(例如顯微鏡)的衍射極限分辨率可以通過不同方式表征。在本文中,我建議使用在 OpticStudio 中計算的點擴散函數(shù) (PSF) 來客觀衡量這些成像系統(tǒng)的分辨率。文中介紹了重疊圖像(探測器)平面上兩個點的 PSF 的兩種方法。第一種方法使用多重結(jié)構(gòu)編輯器,第二種方法使用圖像模擬工具。文中比較了這兩種方法,并討論了它們的優(yōu)缺點。(聯(lián)系我們獲取文章附件)


簡介


成像系統(tǒng)的性能與其分辨率有關(guān),但分辨率的定義各不相同。在超分辨率顯微鏡中,傅里葉環(huán)相關(guān)[1]用于評估分辨率。在衍射極限顯微鏡中,分辨率是用瑞利或斯派羅準(zhǔn)則估算的[2]。在實踐中,這些系統(tǒng)的分辨率也可以用微粒測量,微粒選擇明顯小于預(yù)期分辨率,選定上述標(biāo)準(zhǔn)之一。這些微粒充當(dāng)形成 PSF 的點發(fā)源,其尺寸給出了圖像分辨率的估計值,同樣,該尺寸根據(jù)其定義而變化。在本文中,我們使用 OpticStudio 中的 PSF 來更客觀地評估衍射極限成像系統(tǒng)的分辨率。


方法一:多重結(jié)構(gòu)編輯器(相干成像)


顯微鏡設(shè)計


在整篇文章中,我使用了基于 TL4X-SAP 物鏡(4X,0.2 NA)和 TTL200 管鏡的顯微鏡設(shè)計,如圖1所示。這兩種透鏡都可由 THORLABS 網(wǎng)站以黑盒形式提供。


圖 1 - 由 THORLABS 的黑匣子元件組成的顯微鏡設(shè)計。放大倍數(shù)為 4X,數(shù)值孔徑 (NA) 為0.2。


我們使用“真實圖像高度”定義并指定了在 X 和 Y 半寬為6.656毫米的正方形上具有相等面積的五個視場,對應(yīng)于物平面中的1.664毫米。視場由像面中具有2048x2048像素和13.312x13.312mm2物理尺寸的科學(xué) CMOS (sCMOS) 探測器進(jìn)行建模。這些探測器通常用于顯微鏡,可以在 Orca-Flash4.0 V3 (Hamamatsu) 或Zyla 4.2 plus (Andor) 等相機產(chǎn)品中找到。我還使用了 OpticStudio 的波長 F、d、C(可見光)預(yù)設(shè)。使用標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行優(yōu)化:具有四個環(huán)和六個臂的 RMS 波前質(zhì)心,以及默認(rèn)的空氣邊界約束(0 到 1000 毫米)。此外,該系統(tǒng)還受到遠(yuǎn)心和-4倍放大倍率的限制(在此顯微鏡設(shè)計中,圖像是顛倒的)。


我選擇這種顯微鏡設(shè)計是因為它相對容易設(shè)置并且具有實際應(yīng)用。例如,機器視覺應(yīng)用中通常需要遠(yuǎn)心性。我們始終保持優(yōu)化簡單,本文無意描述顯微鏡設(shè)計的一般情況。然而,本文的結(jié)果和結(jié)論適用于大多數(shù)具有共軛物體和像平面的成像系統(tǒng),其中對衍射的大部分貢獻(xiàn)發(fā)生在出瞳處,這意味著惠更斯點擴散函數(shù) (PSF) 是評價系統(tǒng)性能的一個好參考。


多重結(jié)構(gòu)設(shè)計


為了解決顯微鏡設(shè)計的分辨率問題,我們在物平面中創(chuàng)建了兩個點源,并逐漸將它們分開,距離接近瑞利準(zhǔn)則,并觀察它們的 PSF 如何在圖像平面中重疊。在顯微鏡設(shè)計中,瑞利準(zhǔn)則 yRayleigh 可由下式計算:


其中 λPrimary 是主波長0.588 um,NA 是物鏡的數(shù)值孔徑0.2(本文不討論聚光鏡 NA)。雖然瑞利準(zhǔn)則可以作為系統(tǒng)分辨率的衡量標(biāo)準(zhǔn),但它假定一個完美的圓形、無畸變孔徑光闌和非相干照明。此外,瑞利標(biāo)準(zhǔn)是一種主觀度量,用于確定兩個 PSF 的可辨別性,這實際上取決于觀察者,以及需要從顯微鏡圖像中檢索的信息類型,我們將在本節(jié)的其余部分中看到。


首先刪除除軸上場(場1)以外的所有場,然后將其轉(zhuǎn)換為象度,如圖2所示。


圖 2 - 用于分析顯微鏡分辨率的多配置方法的場設(shè)置。僅保留軸上視場,并且已將其轉(zhuǎn)換為象度。


然后,使用單個 YFIE 操作數(shù)創(chuàng)建兩個結(jié)構(gòu),并在第二個結(jié)構(gòu)中指定值 1.8e-3 mm,如圖3所示。


圖 3 - PSF重疊分析的多重結(jié)構(gòu)設(shè)置。兩個點源在物平面上相距1.8 um。


最后,使用一個惠更斯 PSF 和惠更斯 PSF 截面來分析圖像平面中兩個 PSF 的重疊。兩種分析可以對兩種配置中的各個 PSF 進(jìn)行相干求和(有關(guān)更多詳細(xì)信息,請參閱幫助文件)。分析設(shè)置顯示在圖4中,特殊的多重結(jié)構(gòu)設(shè)置顯示為紅色框和箭頭(此選項不適用于 FFT PSF)。


圖 4 - 惠更斯 PSF 設(shè)置。通過檢查菜單欄中的所有配置,對各個 PSF 執(zhí)行相干求和。


著重分析軸上場的分辨率上,但在各個視場的每個部分都可以進(jìn)行相同的分析。


惠更斯 PSF 的結(jié)果如圖5所示。


圖 5 - 惠更斯 PSF 的結(jié)果,以及 PSF 截面與多重結(jié)構(gòu)中1.8 um(瑞利準(zhǔn)則)的物平面 Y 場分離重疊。在這種顯微鏡設(shè)計中,肉眼很難區(qū)分兩個點光源。


可以看出,兩個場點在圖像平面上嚴(yán)重重疊,它們各自的 PSF 幾乎無法區(qū)分。有兩個原因可以解釋這個結(jié)果。首先,通過執(zhí)行 PSF 的相干求和,違反了瑞利準(zhǔn)則的非相干照明假設(shè),并導(dǎo)致分辨率下降。其次 OPD 扇形圖顯示出0.25波量級的像差,并且該顯微鏡位于衍射極限的邊緣,這意味著它的衍射極限足以進(jìn)行諸如惠更斯 PSF 之類的分析,但它仍然存在一些幾何像差,這改變了系統(tǒng)的衍射極限性能。根據(jù)經(jīng)驗,最大化視野和分辨率的顯微鏡設(shè)計往往屬于近衍射極限系統(tǒng)的類別,并且通常難以僅基于瑞利準(zhǔn)則進(jìn)行表征。


根據(jù)瑞利準(zhǔn)則,可以增加場的分離距離,并重新評估結(jié)果。我們已經(jīng)在圖 6 中完成了它,在物平面中分離了2.3 um。


圖 6 - 惠更斯 PSF 的結(jié)果,以及 PSF 截面與多重結(jié)構(gòu)中2.3 um的物平面 Y 場分離。通過增加點之間的間隔距離,PSF 開始在圖像平面中分離,并且可以觀察到兩個不同的峰值。


隨著更大距離的分離,產(chǎn)生的 PSF 變得可區(qū)分?;莞?PSF 截面中的峰分離幾乎10 um,這與系統(tǒng)放大倍數(shù) (4X) 一致。當(dāng)我們說“可區(qū)分”時,它是對我們在圖 6 中看到的內(nèi)容的定性評估。但是,如果定義了在后處理方面應(yīng)如何分離峰,則可以使該標(biāo)準(zhǔn)更加客觀。例如,一個標(biāo)準(zhǔn)可能是“我希望能夠用80% 的閾值并檢測兩個獨立的點”,在這種情況下,可以使用 OpticStudio 優(yōu)化峰值間距以對應(yīng)于最大相對輻照度的80% (這超出了本文的范圍)。


最后,我們還可以考慮探測器的物理像素大小,以獲得從顯微鏡看到的圖像。PSF 的半高全寬約為12um,我們假設(shè)的探測器的物理像素大小為6.5 um,這顯然違反了 Nyquist-Shanon 采樣定理,這是顯微鏡設(shè)計的另一個限制。圖7顯示了當(dāng)圖像采樣更改為32x32像素且圖像增量(物理像素大?。?.5 um時的惠更斯 PSF 結(jié)果。


圖 7 - 考慮探測器的物理像素大小時,PSF 重疊。像素太少導(dǎo)致 PSF 重疊并進(jìn)一步降低顯微鏡的分辨率。


可以看出,物理像素尺寸不足進(jìn)一步降低了顯微鏡的分辨率,雖然在圖6中可以區(qū)分兩個峰值,但它們現(xiàn)在在圖7中再次重疊。在這種情況下,顯微鏡分辨率被稱為像素受限,并且至少是放大倍數(shù)縮放的像素大小的兩倍,即3.25 um(6.5除以4的兩倍)。物平面中場之間3.25 um分離距離的結(jié)果如圖8所示。


圖 8 - 考慮到探測器的物理像素大小時,PSF重疊。3.25 um的分離使PSF再次分離。該距離對應(yīng)于像素大小除以放大倍數(shù)的兩倍,這是奈奎斯特-香農(nóng)采樣定理的結(jié)果。


考慮探測器像素大小,需要更大的分離以避免 PSF 混疊,并確保它至少由2個像素表示。3.25um的視場間隔與1.8 um瑞利標(biāo)準(zhǔn)大不相同,并且顯示了分辨率的定義是多么模糊,但在本文中還沒有考慮顯微鏡的公差,這將進(jìn)一步降低該指標(biāo)。


本節(jié)中介紹的方法考慮了兩個相鄰 PSF 的相干和,以及如何將它們彼此區(qū)分開來。雖然這種方法適用于相干成像系統(tǒng),但對于非相干成像系統(tǒng)通常更為保守,并且可能導(dǎo)致性能過高的設(shè)計,這本身就成本更高。例如,在熒光顯微鏡中,分辨率是用熒光微珠測量的。從熒光微珠發(fā)出的光通常被認(rèn)為是不相干的。在這種情況下,顯微鏡的性能有望更符合瑞利準(zhǔn)則。


在下一節(jié)中,我將展示如何使用 OpticStudio 的圖像模擬功能,通過非相干地對距離相近的點的 PSF 求和來研究非相干照明假設(shè)下顯微鏡設(shè)計的分辨率。


方法二:圖像模擬(非相干成像)


對于這種方法,可以保留帶有5個視場的原始顯微鏡設(shè)計,并將它們轉(zhuǎn)換為象度(圖 2)。在深入介紹圖像模擬方法之前,我們想通知讀者,本文不涉及OpticStudio 的這個功能的細(xì)節(jié),我們假設(shè)你熟悉它,并且能夠正確設(shè)置它。


設(shè)置圖像模擬的第一步是為其提供輸入圖像文件。由于圖像模擬本質(zhì)上是用這個輸入圖像執(zhí)行顯微鏡 PSF 的卷積,我希望在我的輸入圖像中有多個沖擊函數(shù)來模擬緊密分離的視場。換句話說,我的輸入圖像是一個完全黑色(零值像素)的背景,在每個字段的位置有一個白色(最大值)像素。像素的大小盡可能小,同時保持圖像大小不要過大,這會導(dǎo)致合適的計算時間(以分鐘為單位)。我選擇表示圖5-8中顯示的惠更斯PSF面積的大約四倍,即400x400um2,這構(gòu)成了固有限制。該區(qū)域隨放大倍數(shù)縮放以對應(yīng)于100x100um2的視場大小(請記住,放大倍數(shù)為4X)。我還選擇我的圖像大小為1600x1600像素,因此我的像素尺寸為0.0625x0.0625um2,遠(yuǎn)低于1.8 um的瑞利標(biāo)準(zhǔn)。我在我的圖像中創(chuàng)建了六個白色像素,它們對應(yīng)于兩個近場的三種情況。這三種情況與第一種方法中分析的情況大致相同:分別為 1.8 (29)、2.3 (37) 和3.25 (52) um(像素)。包含白色像素的輸入圖像區(qū)域的放大圖如圖9所示,該圖像可從文章附件 (PointSources.BMP) 中獲得。


圖 9 - 放大輸入圖像,顯示六個白色像素對應(yīng)于由 1.8 (29)、2.3 (37) 和3.25 (52) um(像素)分隔的三對點。橫像間隔為6.25 (100) um(像素),避免了場對之間的重疊。上方的像素位于圖像中的(800, 800)。


圖像模擬的源位圖設(shè)置如圖10所示。


圖 10 - 源位圖的圖像模擬設(shè)置。視場高度為100 um(鏡頭單位為0.1 mm),輸入圖像以同軸視場為中心。


視場高為100 um。對于這種方法,我們還將分析重點放在軸上場上,但也可以在不同的場位置進(jìn)行相同的分析,我使用當(dāng)前系統(tǒng)編輯器中定義的波長1到3的組合。


PSF 網(wǎng)格設(shè)置如圖11所示。


圖 11 - 左圖:圖像模擬功能的卷積網(wǎng)格設(shè)置。由于進(jìn)行分析的區(qū)域受限,因此它在軸上使用單個 PSF。采樣設(shè)置的選擇與惠更斯 PSF 方法相同。像差設(shè)置為衍射。右圖:生成的 PSF 網(wǎng)格,如圖像模擬功能所示。


使用與惠更斯 PSF 方法相同的采樣設(shè)置,并在軸上使用單個 PSF。這樣做是因為視場高度為100um,這對應(yīng)于我不希望 PSF 不會隨著視場的一小部分改變發(fā)生太大的變化。圖像模擬的結(jié)果如圖12所示,默認(rèn)探測器器和顯示設(shè)置(全為零),計算這些結(jié)果可能需要幾分鐘時間。


圖 12 - 使用默認(rèn)探測器和顯示設(shè)置(全為零)的圖像模擬結(jié)果。第一行描繪了穿過兩個 PSF 的中心線的強度分布,第二行是 (A) 3.25、(B) 2.3 和 (C) 1.8 um 場之間的圖像模擬輸出。 由于顯微鏡的光學(xué)特性(負(fù)放大率),圖像被反轉(zhuǎn)。


從圖 12 (C) 中,可以觀察到1.8 um 的間隔(瑞利準(zhǔn)則)下兩個PSF可區(qū)分。強度有大約15%的小幅度下降,可用于使用閾值對圖像進(jìn)行后處理。場之間的距離越大,分離效果越好。與使用多重結(jié)構(gòu)的 PSF 相干總和的惠更斯 PSF方法相比,結(jié)果在 PSF 的可分辨性方面更好。但是,我們還沒有考慮探測器的物理尺寸??梢韵駡D13那樣調(diào)整圖像模擬設(shè)置以考慮檢測器特性。


圖 13 - 考慮顯微鏡探測器物理尺寸時的探測器和顯示設(shè)置。


考慮探測器物理特性的結(jié)果如圖14所示,計算這些結(jié)果可能需要幾分鐘時間。


圖 14 - 考慮顯微鏡探測器物理尺寸的圖像模擬結(jié)果。即使在物平面中3.25 um的分離也不能分離 PSF。6.25um的橫向間距使點對可區(qū)分。


緊密定位的點之間的分離不再可能,并且可以觀察到,嚴(yán)格使用 Nyquist-Shanon 采樣定理來確定像素限制分辨率通常是不夠的。我們可能很幸運找到了圖8的結(jié)果,而這些結(jié)果可能會出現(xiàn)混疊。在物平面中,點對之間的橫向間隔為6.25 um(圖 9),這使得這些場對之間的間隔干凈利落。因此,我假設(shè)分辨率在3.25和6.25um之間。進(jìn)一步的分析表明,5.125um的間隔可使物點的視覺、定性分離,如圖15所示。


圖 15 - 物平面中相距5.125um的一對點的圖像模擬結(jié)果。兩個較亮的像素似乎在強度上是可區(qū)分的。


再次強調(diào),分辨率是一個隨意的標(biāo)準(zhǔn),最好從后處理需求的角度來定義它,但我希望說清楚設(shè)計的那些方面有助于分辨率,并且需要有一個明確的定義以確保對設(shè)計性能的正確評估,這也將有助于進(jìn)行后續(xù)測試。再次強調(diào),我沒有討論公差,這將進(jìn)一步降低實際顯微鏡的性能。